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本制品是一种操作简单、快速、高效、高通量的基于亚硫酸氢盐转化DNA中胞嘧啶(cytosine,C)并最终转变为U并使用磁珠法对其进行纯化回收的试剂盒。DNA经本试剂盒转化处理后未甲基化的C转化为U，而5-甲基胞嘧啶(5mC)不会转化，这样就可以用于后续的PCR或高通量测序检测，以确定特定位点的C是否发生了甲基化修饰。

本试剂盒非常适合用于高通量的96孔的操作，也适用于常规的单管操作。为方便96孔的操作，本试剂盒配套提供了96孔深孔板。

本试剂盒处理后的甲基化DNA可用于各种下游甲基化分析，如甲基化特异性PCR (MSP)、亚硫酸氢盐修饰后PCR扩增产物测序(BSP)、高通量测序、限制性内切酶分析等。


亚硫酸氢盐转化法具有高转化率(>99%)和高度可重复性，是DNA甲基化分析的金标准。使用亚硫酸氢盐处理DNA，未甲基化的胞嘧啶C通过一系列的磺化、脱氨、脱盐和脱磺化反应，最终将未甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶C在转化过程中保持不变，反应原理如图1所示。

图1.DNA中胞嘧啶(Cytosine)发生亚硫酸氢盐转化的原理示意图。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，主要是基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)。在真核生物基因组DNA中，5-甲基胞嘧啶是最普遍的化学性修饰碱基，而且CpG双核苷酸是基因组中最主要的甲基化位点。

DNA甲基化在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记、X染色体失活以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大的作用，在衰老与疾病的发生及发展进程中有着深远的影响。目前已证明DNA甲基化与多种疾病存在密切的关系，如肿瘤、精神疾病、代谢性疾病、自身免疫疾病等。DNA甲基化可作为分子标志物或靶点为疾病精准诊断和治疗提供帮助。

组分	96T	4×96T
转化液粉末	10管	40管
溶液I (保护液)	1.1mL	4.2mL
溶液II (反应液)	18mL	72mL
溶液III (洗涤液)	40mL	2×80mL
溶液IV(洗脱液)	3mL	12mL
BalbMag磁珠	30mL	120mL
深孔板	1块	4块

保存：室温，有效期3个月。

• BalbMag磁珠4℃保存，一年有效；其余室温保存至少一年有效。
  
• 本试剂盒最终使用磁珠对DNA样本进行纯化回收，须自备磁分离架。如果使用试剂盒提供的深孔板进行96个样品或较多样品的操作，须自备适当的96孔磁分离架。本试剂盒也可以使用普通离心管进行单管的转化和磁性分离操作的。
  
• 转化液建议即用即配，每管转化液粉末溶解后可进行10次实验。未用完的转化液可室温或4℃保存一天，或者-20℃保存一个月。
  
• 磁珠悬液在静置后会发生沉降，使用前一定要涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。
  
• 用户需自备无水乙醇，40mL或80mL溶液IV (洗涤液)第一次使用前需加160mL或320mL无水乙醇并混匀，后续注意拧紧瓶盖并在瓶上做好标记。
  
• 转化液粉末和溶液I (保护液)对人体有害或有刺激性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本试剂盒采用热变性与亚硫酸氢盐转化相结合的方式处理DNA样本，随后使用磁珠对样本进行纯化，将脱盐和脱磺化反应整合在磁珠纯化过程中，使实验流程更便捷，不需要离心，操作更简单，适用于自动化高通量平台，3小时内即可完成。本试剂盒操作流程如图2所示。

图2.DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒(磁珠法)操作流程示意图。


本试剂盒转化率高、回收率好。DNA样本起始量的适用范围为10ng～2μg，0.5～2μg效果更佳。

图3.DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒(磁珠法)转化和回收的效果图。分别使用10ng、100ng、500ng、1μg和2μg未甲基化的lambda DNA，或者500ng甲基化的lambda DNA作为样品，按照本试剂盒的使用说明对样本进行亚硫酸氢盐转化和磁珠法纯化回收处理，甲基化特异性PCR(MSP)技术验证确认本制品具有高转化效率。U代表使用非甲基化特异性引物进行PCR扩增(上游引物：5'-ATGTTTGAAATGTTTGTTGTAATGT-3'，下游引物：5'-TATTATTTATTCCCCTAAACACAAT-3')，扩增产物长度为139bp；M代表使用甲基化特异性引物进行PCR扩增(上游引物：5'-TACGTTTGAAACGTTTGTTGTAAC-3'，下游引物：5'-AATATTATTTATTCCCCTAAACGCG-3')，扩增产物长度为135bp。实际检测结果会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中检测结果仅供参考。

• 转化液的配制
  取1管转化液粉末加入100μL溶液I (保护液)和1.4mL溶液II (反应液)，室温涡旋或上下颠倒至转化液粉末完全溶解。每管转化液可用于10次实验，用户可根据反应数量的需求进行配制。
  • 未用完的转化液可室温或4℃保存一天，或者-20℃保存一个月。
• 转化反应
  • 取10ng～2μg样本DNA加入PCR管/板孔中，体积不可超过20μL。不足20μL的部分，请用超纯水补足。
    • 优先推荐的用量为0.5～2μg，通常样品量大，操作会比较容易，后续的检测也会比较方便；但如果样品量确实非常少，可以使用低至10～500ng的样品量，但后续的检测效果等会有所下降。超纯水推荐使用无菌无酶超纯水。
  • 向PCR管/板孔中加入130μL配制的转化液，振荡或吹打混匀。
    
  • 约1000～10000×g离心5秒，将管/板孔壁上的混合液离心至管底。
    
  • 将PCR管/板置于PCR仪中，按照下表进行反应。
    

    步骤	温度	时间	循环数
    初始变性	95℃	3min	1
    变性	95℃	30sec	12
    转化	70℃	10min
    Hold	4℃	forever	1

• 磁珠纯化
  
  • 如果BalbMag磁珠在4℃保存，需要提前平衡至室温。
  • 将转化反应结束的PCR管/板中的150μL转化反应产物转移至对应的深孔板中，加入300μL BalbMag磁珠，轻轻震动或摇动混匀。
    • 此时也可以转移至1.5mL离心管中进行操作，本说明书后续仅以深孔板为例进行描述，如果使用1.5mL离心管，每管的液体和磁珠的使用量和深孔板每孔的用量相同。
  • 室温静置5～15分钟。
    • 通常孵育5分钟就会有比较好的结合效果，但如果DNA的初始样品量非常少，例如低于100ng的情况，把孵育时间延长至10～15分钟对于提高结合效果会有所帮助。
  • 将深孔板置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集并且溶液澄清后，弃上清。
    • 吸取上清时，请勿碰触到孔底磁珠。
  • 将深孔板从磁力架上取出，每孔加入400μL溶液III(洗涤液)，轻轻吹打混匀磁珠，使其全部悬浮。
    • 40mL或80mL溶液III第一次使用时请注意加入160mL或320mL无水乙醇，并做好标记。
  • 置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集并且溶液澄清后，弃上清。
• 脱磺反应
  
  • 按照每20μL溶液II (反应液)加入180μL无水乙醇的比例，配制脱磺反应溶液。可根据实际反应数量适量进行配制。
    
  • 将深孔板从磁力架上取出，每孔加入200μL脱磺反应溶液，轻轻震动或摇动混匀磁珠，使其全部悬浮于脱磺反应溶液中。
    
  • 室温静置20分钟。
    • 静置时间不能太短，太短会影响脱磺效果；静置时间也不能太久，太久会影响DNA与磁珠的结合。
• 洗涤
  
  • 将深孔板置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集并且溶液澄清后，弃上清。
    
  • 将深孔反应板从磁力架上取出，每孔加入400μL溶液III (洗涤液)，轻轻震动或摇动混匀磁珠使其全部悬浮，室温孵育30秒。
    
  • 将深孔板置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集并且溶液澄清后，弃上清。
    
  • 重复步骤b和c一次。
    
  • 保持深孔板始终处于磁力架上，打开盖子，室温干燥至磁珠表面干燥(约5～10min)。
• 洗脱
  
  • 将深孔反应板从磁力架上取出，每孔加入20μL溶液IV (洗脱液)，漩涡振荡以充分混匀。
    
  • 室温静置3～5分钟。
    
  • 将深孔反应板短暂低速离心后置于磁力架上，待磁珠完全聚集并且溶液澄清后，小心吸取上清至洁净的PCR板或其它适当容器中，即完成转化产物的纯化回收。
    
  • 将经转化处理的DNA样本保存于-20℃，长期保存建议放置于-80℃。

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